Desenvolvimento de um radioimunoensaio de dexametasona no soro como subsídio para o diagnóstico da síndrome de Cushing / Development of serum dexamethasone radioimmunoassay to corroborate Cushing's syndrome diagnosis

INTRODUÇÃO: O teste de supressão com 1 mg de dexametasona (TSDx) é amplamente empregado no rastreamento da síndrome de Cushing (SC) dada sua elevada acurácia diagnóstica. A SC é um distúrbio endocrinometabólico resultante do hipercortisolismo crônico com característica de ausência de supressão do cortisol no TSDx. OBJETIVO: Desenvolver um radioimunoensaio (RIE) para a dosagem de dexametasona (Dx) no soro para complementar o TSDx. MÉTODOS: Foram imunizados três coelhos com o conjugado dexametasona-21-hemissuccinato-BSA para escolha do melhor anticorpo e o RIE foi desenvolvido de acordo com as recomendações da RE 899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Analisamos 96 voluntários, sendo 67 submetidos ao TSDx e 29 não, e 12 pacientes com SC, estudados na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. RESULTADOS: O anticorpo contra Dx selecionado mostrou boa especificidade, coeficiente de variação (CV por cento) intra e interensaio < 20 por cento, exatidão de 93,8 por cento e dose mínima detectada de 19,5 ng/dl. A concentração de Dx no soro foi semelhante nos voluntários e pacientes com SC (ausência/supressão do cortisol): 205 a 703 ng/dl e 174 a 661 ng/dl (intervalo de confiança [IC] 95 por cento), respectivamente; os valores foram indetectáveis naqueles que não se submeteram ao teste. DISCUSSÃO: O anticorpo empregado apresenta boa afinidade e especificidade para quantificar a Dx no soro. O RIE mostrou reprodutibilidade e eficiência na determinação dos níveis séricos de Dx durante o TSDx. CONCLUSÃO: O presente RIE para a dosagem de Dx no soro é acurado e confiável, permitindo estabelecer uma faixa de referência de valores para subsidiar a interpretação do TSDx.

INTRODUCTION: The 1 mg dexamethasone suppression test (DxST) is widely used to screen Cushing's syndrome (CS) due to its high diagnostic accuracy. CS is an endocrine-metabolic disorder caused by hypercorticism, which is characterized by the absence of cortisol suppression in DxST. OBJECTIVE: To develop a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of serum dexamethasone (Dx) to complement DxST. METHODS: Three rabbits were inoculated with dexamethasone-21-hemisuccinate-BSA in order to choose the best antibody. Serum Dx RIA was performed according to RE 899/2003 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária [ANVISA]) regulations. Serum samples from 96 volunteers from Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) and Santa Casa de Misericórdia de São Paulo were analyzed, 67 of which were submitted to DxST and 29 were not. There were 12 patients with CS. RESULTS: The Dx antibody chosen showed good specificity. Intra- and interassay CV were < 20 percent with 93.8 percent accuracy and the lowest detection limit was 19.5 ng/dl. Serum Dx concentration was similar among both volunteers and CS patients (absence of cortisol suppression): 205 to 703 ng/dl and 174 to 661 ng/dl (95 percent CI), respectively. Values were undetectable among those that were not submitted to the test. Discussion: The anti-Dx antibody shows high specificity and reliability to quantify serum Dx in DxST. The Dx RIA presented reproducibility and reliability in the determination of serum Dx levels during DxST. CONCLUSION: The current RIA for serum Dx is accurate and reliable, which permits to establish a reference value range to substantiate DxST interpretation.

Aplicaçäo da cromatografia líquida de alta performance como método preparativo para a dosagem de esteróides hormonais por RIE: dosagens de 17OH-progesterona e diidrotestosterona / Application of the high performance liquid chromatography as a preparative method for the hormonal steroid dosage for RIE: 17OH-progesterone and dihydrotestosterone dosages

A dosagem dos esteróides hormonais tem apresentado evoluçäo técnica significativa, sendo' os principais esteróides de interesse clínico dosados, atualmente, por métodos simples, rápidos e automatizados. Existe, no entanto, um compromisso em detrimento da exatidäo, que é mais evidente na determinaçäo de esteróides de menor concentraçäo relativa e maior número de interferentes potenciais, como a 17-hidroxiprogesterona (170HP), a diidrotestosterona (DHT) e outros. Nestes casos, um processo preparativo versátil e robusto é fundamental para garantir resultados com alto grau de exatidäo. Apresentamos a padronizaçäo de um processo preparativo baseado em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) comparado à cromatografia em coluna de celite para a dosagem de 170HP e DHT. Os anticorpos empregados nos respectivos radioimunoensaios apresentam especificidade semelhante aos descritos na literatura. As amostras foram inicialmente extraídas em éter etílico e em seguida submetidas ao processo cromatográfico. Amostras de soro provenientes da rotina foram dosadas em paralelo pelos dois métodos, sendo 57 amostras para 170HP e 84 para DHT. Näo houve diferença significativa entre os resultados, e os índices de correlaçäo foram elevados (R= 0,95 e 0,97). Os resultados comprovam que a aplicaçäo do HPLC é válida, além de ser mais reprodutível, versátil e menos operador-dependente. Sua aplicaçäo mais ampla permitirá uma melhora de exatidäo na dosagem de esteróides de baixa concentraçäo relativa, onde os métodos mais simples resultam em valores falsamente elevados.

Desenvolvimento e caracterizaçäo de método para a dosagem de cortisol livre urinário / Development and characterization of method for dosage of urinary free cortisol

A dosagem de cortisol livre na urina de 24 horas é considerada por muitos como a dosagem mais útil na pesquisa da presença de síndrome de Cushing. Os resultados publicados são, no entanto, pouco comparáveis entre si em função de diferenças metodológicas importantes, relacionadas principalmente aos processos preparativos, sendo que a especificidade é diretamente proporcional à complexidade dos mesmos. Neste trabalho descrevemos a adaptação de um ensaio de rotina, desenvolvido originalmente para a medida de cortisol sérico, para a medida de cortisol urinário. O antisoro empregado, F-79-1, foi estudado quanto à especificidade em relação aos principais metabólitos urinários de cortisol, sendo os resultados obtidos comparáveis aos dos melhores antisoros descritos na literatura. O método preparativo utilizado faz uso de extração de alíquota de urina com diclorometano, seguida de cromatografia em coluna de Sep-Pak Diol. A recuperação média do processo foi de 63,3 por cento; a sensibilidade do ensaio é da ordem de 1,6 mg/L e os coeficientes de variação intra e inter-ensaio da ordem de 7,2 e 15,6 por cento, respectivamente. Os resultados obtidos em 40 amostras de indivíduos normais foram de 21,9 a 74,1 mg/24hs (média de 47,8); a comparação com método semelhante de laboratório de referência internacional mostrou alta correlação (R= 0,9286, n= 74, p<0,001). Em quatro pacientes com doença de Cushing comprovada os valores foram significativamente elevados. O presente método, empregando antisoro próprio e processo preparativo simples, vai permitir uma aplicação mais ampla do teste e uma melhor avaliação de sua utilidade clínica.

Produçäo de anticorpos monoclonais contra dehidroepiandrosterona (DHEA) e seuemprego no desenvolvimento de ensaios para a dosagem sérica de DHEA-sulfato (DHEA-S) / Monoclonal antiboidies against dehtdroepiandrosterone(DHEA) and their use in the development of assays for serum measurement of DHEA-sulphate (DHEA-S)

Neste trabalho, descrevemos nossa experiência na produçäo e caracterizaçäo de anticorpos monoclonais contra o sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S), sua caracterizaçäo e seu uso no desenvolvimento de radioimunoensaios tradicionais, mediante a comparaçäo dos resultados obtidos com um radioimunoensaio clássico empregando anticorpo policlonal. Foram caracterizados três anticorpos monoclonais (H6P4, B2P2 e G10p6) que apresentam coeficientes de afinidade entre 4 x 108 e 1,6 x 109 L/M e especificidades variáveis. A comparaçäo entre os valores obtidos com os três anticorpos monoclonais e aqueles obtidos com o ensaio tradicional mostrou excelente grau de correlaçäo. Os valores obtidos com o anticorpo monoclonal B2P2 apresentaram melhor índice de correlaçäo. Estudos adicionais mostraram que as características do ensaio, que empregou o anticorpo monoclonal B2P2, säo semelhantes àquelas do ensaio tradicional com anticorpo policlonal. Os anticorpos monoclonais obtidos podem servir de base para ensaios mais simples para a dosagem sérica de DHEA-S

Valores falsamente elevados em ensaios diretos para a medida de hormônios esteróides no soro / Falsely elevated serum steroid hormone levels in direct assays

A dosagem sérica dos esteróides hormonais ainda se baseia no emprego de técnicas radioimunológicas, sendo que as metodologias clássicas empregam extraçäo e, se necessário, cromatografia preparativa. A necessidade de ensaios mais rápidos, simples e susceptíveis à automaçäo forçou o desenvolvimento de ensaios diretos de hormônios esteróides no soro, principalmente para os de maior interesse clínico como o estradiol, a testoterona e a progesterona. Neste trabalho descrevemos o encontro de resultados falsamente elevados com o emprego de ensaios diretos e automatizados para as medidas séricas de estradiol e de progesterona. a pré-extraçäo das amostras com solvente orgânico faz com que o fenômeno desapareça. Säo discutidas as possíveis razöes para este fenômeno e como conclusäo salientamos a necessidade de nova dosagem, após extraçäo, de amostras que apresentarem valores surpreendentemente elevados para a condiçäo clínica da paciente

Estudo de um radioimunoensaio para a dosagem de testosterona sérica empregando anticorpo monoclonal / Study of a monoclonal antibody-based radioimmunoassay for serum testosterone

Apresentamos os resultados por nós obtidos na produção e uso de um anticorpo monoclonal contra testosterona. Camundongos foram imunizados com o conjugado de testosterona acomplado a partir da posição 3 com albumina bovina. As técnicas de produção foram as clássicas e um monoclonal (C7P4) foi escolhido com base em suas características de afinidade e especificidade. A comparação da especificidade deste monoclonal com um policlonal gerado contra o mesmo conjugado, em relação a um número limitado de esteróides mostrou serem os mesmos superponíveis. A aplicação do monoclonal produzido num radioimunoensaio clássico mostrou um ensaio de características de sensibilidade e erro semelhante às obtidas com o policlonal. A dosagem de 206 amostras de soro submetidas à extração etérea simples pelos dois ensaios (mono e policlonal) mostrou que o monoclonal resultou em valores significativamente mais baixos, com medianas de 58 ng/dl e 98 ng/dl, respectivamente (P<0,0001). O esudo adicional de 40 amostras de soro submetidas à extração simples e à extração seguida de cromatografia em coluna de Celite, mostrou que os resultados obtidos com o ensaio monoclonal nas amostras com extração simples eram semelhantes às obtidas com o ensaio policlonal nas mesmas amostras submetidas à extração e cromatografia (p=0,1483). Nossos dados sugerem que o monoclonal produzido pode servir de base para ensaios mais simples e específicos para a dosagem de testosterona sérica, bem como para o desenvolvimento de ensaios não-competitivos

Desenvolvimento de ensaio imunométrico para a dosagem sérica da subunidade alfa dos hormônios glicoproteicos / Development of an immunoflurometric assay for serum alfa subunit of the glycoprotein hormones

Tendo como base um anticorpo monoclonal e um policlonal, desenvolvemos um ensaio imunofluorométrico para a medida de subunidade alfa no soro. O anticorpo monoclonal contra subunidade alfa, empregado para captura, foi produzido a partir de um camundongo imunizado contr LH e apresenta reatividade cruzada contra as formas íntegras dos hormônios glicoproteicos. Já o anticorpo policlonal foi produzido em coelho imunizado com subunidade alfa livre e apresenta baixa reatividade cruzada com os hormônios íntegros. Para a revelaçäo da ligaçäo do policlonal à subunidade capturada pelo monoclonal, empregamos um monoclonal anti-IgG de coelho marcado com európio. O ensaio apresenta reatividade cruzada de 2,8 por cento com hCG, 3,2 por cento com FSH, 6,4 por cento com TSH e 9,4 por cento com LH. A sensibilidade é da ordem de 50 ng/L, com perfil de imprecisäo mostrando um erro intraensaio inferior a 10 por cento entre os valores 100 e 20.000 ng/L. O coeficiente de variaçäo interensaio mostrou-se inferior a 14 por cento dentro da faixa de valores encontrados. A definiçäo de valores normais foi feita a partir de uma populaçäo normal de 66 adultos, 33 homens e 33 mulheres na menacme, onde encontramos valores entre 70 e 902 ng/L, com mediana de 236 ng/L. Em 14 mulheres mnenopausadas econtramos valores entre 1.498 e 3.919ng/L. A aplicaçäo do ensaio em 33 pacientes com diagnóstico de tumor hipofisário (11 acromegálicos, 15 prolactinomas, 6 tumores "näo secretores" e 1 tumor produtor de TSH) mostrou valores elevados em 11 pacientes

Desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra progesterona e seu emprego em dosagens séricas / Development of monoclonal antibodies against progesterona and its utility in serum assays

Anticorpos monoclonais foram desenvolvidos contra um derivado de progesterona-11-hemissucinato acoplado a albumina bovina. O estudo comparativo da especificidade do anticorpo de melhores características (F4P4) contra um anticorpo policlonal, produzido em coelho contra o mesmo tipo de derivado, mostrou características equivalentes. O radioimunoensaio desenvolvido com o monoclonal emprega extraçåo prévia do soro, traçador iodado e método de separaçåo com polietilenoglicol. A sensibilidade com o emprego de amostras de 0,5ml de soro é de 2 ng/dL (0,06 nmol/L) e o coeficiente de variaçåo intraensaio mostrou-se inferior a 10 entre as concentraçöes de 17 e 845 ng/dL (0,54 e 26,9 nmol/L). A dosagem, em paralelo, de 37 amostras de soro com método aqui descrito e um radioimunoensaio clássico mostrou alta correlaçåo (r=0,912). A comparaçåo foi feita também com um ensaio comercial (DELFIA Progesterone Kit), que dispensa extraçåo, em 154 amostras de soro, obtendo-se uma correlaçåo de r=0,900, sendo que o ensaio empregando o anticorpo monoclonal apresenta valores mais exatos na faixa inferior a 100 ng/dL (3,18 nmol/L)